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1、分離制備單細(xì)胞懸液： （1）體外培養(yǎng)的細(xì)胞株：用胰酶消化，最后用PBS懸浮吹打成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞要計(jì)數(shù)，具體的量我前邊已經(jīng)說(shuō)過(guò)。 （2）體內(nèi)臟器細(xì)胞：處死動(dòng)物，取出臟器，于Hanks’液中制備成單個(gè)細(xì)胞懸液。 2、膠板制備： （1）取100μl于45℃水浴中保溫的0.5%NMA，鋪于磨沙載玻片上，形成底膠。蓋玻片推勻，不能有氣泡，4度凝固5至8分鐘。 （2）水平取下蓋片，取100μl于37℃水浴中保溫的0.5%LMA與20μl細(xì)胞懸液（約400個(gè)細(xì)胞）混勻，立即鋪片，加上蓋玻片，4度凝固5至8分鐘。 3、細(xì)胞裂解與電泳： （1）將制備好的膠板去掉蓋玻片后，浸于4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中，在4℃下裂解2.5到3小時(shí)。 （2）取出膠板，用雙蒸水浸沒(méi)漂洗后放入電泳槽中，浸泡在4℃預(yù)冷的電泳液中解旋20分鐘。 （3）玻片水平放置陽(yáng)極端附近，4℃電泳20到25分鐘（25V，300mA）。可在電泳槽周?chē)颖鶋K以保持低溫。 4、中和與染色： （1）電泳結(jié)束，將膠板浸泡于中和液中，每次10分鐘，共中和3次，每次要更換中和液。最后晾干。 （2）取出膠板，置于染色缸中，在2μg/ml的EB染色液中，暗處染色5到10分鐘。 （3）蒸餾水漂洗2次，每次5分鐘。 稍晾干，濾紙吸去多余水分，盡快在熒光顯微鏡下觀察。 從膠板制備開(kāi)始到最后都應(yīng)該在暗光下操作。 |
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