X-VIVO 限定化學(xué)成分無血清造血細(xì)胞培養(yǎng)基
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一 抗體選擇指南
:檢測(cè)任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，為縮小抗體的選擇范圍選中合適的抗體，需
要考慮如下幾種因素：
1. 分析或應(yīng)用的類型
2. 樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)
3. 樣本的種屬
4. 抗體宿主的種類
5. 抗體的標(biāo)記和檢測(cè)
1 分析試驗(yàn)的應(yīng)用類型一般抗體說明書都列出該抗體經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證過適用于何種分析類型，如：
可以應(yīng)用于WB IHC ICC ELASA 分析等，如果抗體說明書沒有提及的應(yīng)用類型，并不意味
著該抗體不適用于此種分析應(yīng)用類型，而僅是說明尚未經(jīng)過此種分析試驗(yàn)驗(yàn)證，如果抗體不適用
某些分析試驗(yàn)，則會(huì)在抗體說明書上標(biāo)注出來不適于某分析試驗(yàn)。
2 樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)了解樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有助于選擇最合適的抗體，至少兩方面因素
需要考慮
(1)..待測(cè)樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域：抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來，其中的免疫原包括：
全長(zhǎng)蛋白、蛋白片斷、多肽、全有機(jī)體（如：細(xì)菌）或細(xì)胞，抗體說明書一般都有免疫原的描述，
如果打算檢測(cè)的是蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長(zhǎng)的某一區(qū)域，則必須選擇用含此片段
域的免疫原制備出的抗體。如果打算用FACS 流式檢測(cè)活細(xì)胞的表面蛋白，則需要選擇含該表
面蛋白的胞外域來免疫制備的抗體。
(2)樣本的提取或處理過程：某些抗體要求樣本經(jīng)過某些特殊處理，例如：許多抗體只識(shí)別還原
和變性的、表位已暴露不受二級(jí)四級(jí)結(jié)構(gòu)阻礙的蛋白樣本，另一方面，某些抗體僅識(shí)別天然折疊
狀態(tài)的蛋白。當(dāng)選擇免疫組化的抗體時(shí)，應(yīng)注意某些抗體只識(shí)別未固定的冷凍的組織，而另一些
抗體則適用于無需抗原修復(fù)解交聯(lián)步聚的甲醛固定石蠟包埋的組織，這些都會(huì)在抗體說明書上應(yīng)
用部分標(biāo)示出來
3 樣本的物種 應(yīng)選擇物種相同或有交叉反應(yīng)的抗體，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交
叉反應(yīng)，因其氨基酸序列同源性較高，如果樣本的種類未列入抗體說明書上的交叉反應(yīng)種屬表中，
并不意味著該抗體不適用于檢測(cè)該物種的蛋白，而只是表示該物種尚未用此抗體檢測(cè)驗(yàn)證過，應(yīng)
通過序列比對(duì)的方法來預(yù)測(cè)交叉反應(yīng)，可應(yīng)用Expasy 和 NCBI BLAST 來進(jìn)行不同物種蛋白同
源性比對(duì)。
4 一抗宿主物種的選擇一般說來，在使用偶聯(lián)二抗結(jié)合無偶聯(lián)物的一抗時(shí)，一抗宿主動(dòng)物的
物種選擇較為重要，對(duì)于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗
與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)，例如：檢測(cè)小鼠樣本蛋白，則不應(yīng)選擇小鼠或大鼠源的
一抗，最好選兔源的一抗，則二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測(cè)分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。
如果選擇有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況，除免疫組化外的其它對(duì)不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本
的檢測(cè)方法，則抗體宿主物種的影響不大，如對(duì)不含IgG 的細(xì)胞裂解物樣本的western blotting
檢測(cè)，盡管如此，含有血清的組織裂解物和組織培養(yǎng)上清中含有免疫球蛋白，還原變性樣本中含
IgG，在western blot 檢測(cè)中則結(jié)合出現(xiàn)IgG 分子50 and 25 kDa 的重鏈和輕鏈條帶。
5 二抗的選擇 二抗應(yīng)選用與使用的一抗相同的物種來源，例如：如果你的一抗是小鼠的單克
隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗anti-mouse secondary。建議檢查二抗說明書確保該抗體適用于你
的檢測(cè)應(yīng)用， 二抗一般連接熒光素FITC 或發(fā)光團(tuán)。
6 雙重染色抗體的選擇用未偶聯(lián)一抗進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)物或組織切片的雙重免疫染色要求一抗
來源于不同物種并且二抗分別識(shí)別其中之一，二抗說明書應(yīng)描述其與其它物種來源的免疫球蛋有
否有交叉吸附。
7 熒光和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記連接于二抗的標(biāo)記物是為了檢測(cè)抗體的結(jié)合，選擇標(biāo)記物依賴于幾個(gè)參
數(shù)：檢測(cè)方法：熒光或著色沉淀，熒光標(biāo)記物用特殊波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)發(fā)射出可見光，下表列出了
幾種熒光素的分子特征：
熒光素顏色 激發(fā)波發(fā)射波長(zhǎng)分子量
Aminomethylcoumarin (AMCA) Blue 353 440 410
Fluorescein (FITC) Green 495 528 390
Fluorescein (DTAF) Green 495 528 530
Rhodamine (TRITC) Red 550 570 444
Texas Redtm Red 596 620 625
Cy2tm Green 489 505 897
Cy3tm Orange 552 565 949
Cy3.5tm Scarlet 581 596 1,286
Cy5tm Far-Red 650 667 975
Cy5.5tm Near Infra-Red 678 703 1,312
Cy7tm Near Infra-Red 743 767 1,001
R-Phycoerythrin (RPE) Red 488 575 240,000
B-Phycoerythrin (BPE) Red 545 575 240,000
C-Phycocyanin Red 618 640 110,000
R-Phycocyanin Red 615 620 110,000
二抗連接標(biāo)記酶HRP and AP 與其底物產(chǎn)生有顏色的沉淀物
辣根過氧化物酶
Horseradish peroxidase (HRP)
堿性磷酸酶
Alkaline phosphatase (AP)
AEC (red) Fast red (pink)
DAB (brown) INT (yellow / brown)
NBT (brown / purple)
New Fuchsin (red)
TNBT (purple)
Vega red (pink)
封片介質(zhì)（僅免疫組化）. AEC, Fast Red, INT 或其它水性發(fā)光基團(tuán)是可以醇溶的并要求水
性封片. 除上述之外的發(fā)光基團(tuán)是有機(jī)的所以最好使用有機(jī)性封片介質(zhì)。
熒光素標(biāo)記物要求水性封片介質(zhì)，藻紅蛋白(藻青素 / 藻紅素要求不添加甘油的水性封片介
質(zhì)，因其有淬滅熒光的效應(yīng)，
生物素化的抗體通常用于加強(qiáng)親和素-生物素-酶或熒光素復(fù)合物（ABC 試劑 或親和素或鏈霉
親和素連接酶或熒光素的信號(hào)）
抗體保存指南
抗體保存得當(dāng)與否，直接決定了抗體的活性和使用效果！如果抗體保存得當(dāng)，大部分抗體活性都
可以維持?jǐn)?shù)月甚至數(shù)年。本指南以abcam 抗體保存方法為主，同樣也可以應(yīng)用到其他絕大部分公
司的抗體產(chǎn)品！
請(qǐng)謹(jǐn)記！無論何時(shí)請(qǐng)按照說明書推薦的保存條件正確保存抗體！
1. 收到抗體后請(qǐng)務(wù)必在12000rpm 離心20-30s 后再打開管蓋進(jìn)行分裝和保存！
質(zhì)優(yōu)的抗體使用非常特殊的儲(chǔ)存管，只有在12000rpm 離心20-30s 才能將附著在管壁或蓋內(nèi)的
抗體全部離心下來。即使是在10000rpm 離心也會(huì)導(dǎo)致離心不完全，導(dǎo)致出現(xiàn)抗體的量不足的現(xiàn)
象！
o 2. 對(duì)于大部分抗體，比較合適的保存方式是分裝后保存在 -20 度 or -80 度對(duì)
絕大多數(shù)抗體來說，保存在-20 度是完全足夠了。沒有任何證據(jù)顯示保存在-80
度 會(huì)有更多的好處！
o 分裝可以最大程度的降低反復(fù)凍融對(duì)抗體活性的損害，同時(shí)也降低了由于多次
從同一管中吸取抗體造成的污染可能性。
o 分裝的量以一次實(shí)驗(yàn)用完為好，最少不能少于10ul 每份。因?yàn)榉盅b體積越小，
抗體的濃度越可能會(huì)受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響
o 復(fù)融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在4 度，避免再凍起來！
o 抗體工作液應(yīng)該當(dāng)天配制當(dāng)天用完，在4 度 盡量不要超過1 天。
o 絕對(duì)避免將抗體保存在自動(dòng)除霜冰箱中。盡量將抗體保存在冰箱里層，而不是
門上
3. 大部分抗體收到后4 度短暫保存1-2 周對(duì)抗體活性是沒有影響的。
如果抗體很快（1-2 周）會(huì)使用，推薦在4 度保存，這是為了避免反復(fù)凍融對(duì)抗體活性的損害。
如果要長(zhǎng)期保存則最好是在-20 度 or -80 度。最關(guān)鍵的一點(diǎn)是要根據(jù)說明書推薦的方式來正確
的保存抗體！
但是，腹水形式的產(chǎn)品請(qǐng)?jiān)谑盏胶罅⒓磧銎饋?！因?yàn)樵擃惍a(chǎn)品含有大量的蛋白酶，長(zhǎng)期在4 度保
存會(huì)導(dǎo)致抗體的降解！
4. 大部分抗體的運(yùn)輸條件：一般的運(yùn)輸過程需要1-2 周的時(shí)間，所以是在4 度的條件下來完成
的。
4 度運(yùn)輸最主要的目的是為了避免反復(fù)凍融對(duì)抗體活性的損害（如果使用干冰運(yùn)輸，那么收
到時(shí)抗體是凍起來的，為了分裝就需要解凍。這就多了一次凍融的過程）。所以運(yùn)輸過程中絕對(duì)
避免干冰運(yùn)輸！
特殊抗體的保存條件：
1. 酶聯(lián)抗體：永遠(yuǎn)保存在4 度，避免凍起來。否則會(huì)導(dǎo)致酶活性的下降或者喪失
2. 偶聯(lián)抗體：所有偶聯(lián)抗體都是在棕色管中或使用錫箔紙避光保存。尤其是熒光抗體，對(duì)
光極為敏感，因此在所有的實(shí)驗(yàn)階段也是要避光操作的！
3. IgG3 的同型對(duì)照：永遠(yuǎn)保存在4 度，避免凍起來。因?yàn)槿绻霈F(xiàn)凍融過程，該抗體非常
容易形成多聚體
無論是保存還是運(yùn)輸，絕對(duì)避免反復(fù)凍融！
反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致抗體變性，導(dǎo)致多聚體形成，從而降低抗體的結(jié)合能力！
抗體保存其它相關(guān)信息：
關(guān)于加入甘油保存：有些人會(huì)加50%的甘油到抗體中來避免反復(fù)凍融，甘油在-20 度 會(huì)降低冰
點(diǎn)。這對(duì)很多抗體可能是可行的。但是abcam 僅對(duì)非常小的一部分抗體檢測(cè)過其在這種條件下的
穩(wěn)定性；而abcam 只對(duì)按照推薦條件保存的抗體提供質(zhì)量保證！加入甘油的溶液不建議在-80 度
保存，因?yàn)檫@已經(jīng)超過了甘油的冰點(diǎn)。如果您要加入甘油來保存抗體的話，請(qǐng)謹(jǐn)慎注意無菌操作，
避免污染！
關(guān)于蛋白保護(hù)劑：
蛋白在高濃度時(shí)更不容易降解（1 mg/ml 或者更高），這就是為什么在抗體中加入BSA 之類作為
穩(wěn)定劑的原因了；另一方面，加入的蛋白也可以減少抗體由于管壁吸附所造成的損失。但是如果
抗體要用來標(biāo)記的話，則不能加入蛋白穩(wěn)定劑，因?yàn)檫@些穩(wěn)定劑會(huì)和抗體一起競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合標(biāo)記物。
關(guān)于疊氮化鈉（sodium azide）的使用：
為了防止微生物污染，疊氮化鈉經(jīng)常被加入到抗體中（終濃度0.02% (w/v)）。Abcam 的很多抗
體已經(jīng)含有了0.02％-0.05%的疊氮化鈉，在說明書的“Storage buffer”中有標(biāo)明的。
在下述情況中不能使用疊氮化鈉：
• 如果抗體用于染色或處理活細(xì)胞，用于體內(nèi)研究：
疊氮化鈉在抵抗微生物的同時(shí)，對(duì)其它大部分有機(jī)物也是有毒的，因?yàn)樗钄嗔司€粒體的
cytochrome electron transport system.
• 要偶聯(lián)帶有氨基基團(tuán)的抗體：
疊氮化鈉會(huì)干擾任何含有氨基基團(tuán)的偶聯(lián)，因此在進(jìn)行偶聯(lián)之前，應(yīng)將疊氮化鈉去除。偶聯(lián)后的
抗體可以加入疊氮化鈉保存，但是濃度只能是0.01％。對(duì)于需要偶聯(lián)的抗體，thimerosal
(merthiolate)可以替代疊氮化鈉作為保護(hù)劑！
注：疊氮化鈉的去除方式：
可以通過凝膠電泳或過濾的方式去除！IgG 的分子量是150kDa (IgM 是~ 600kDa); 疊氮化鈉的
分子量只有65Da。使用cut off 14kDa 的濾膜即可將疊氮化鈉從抗體中去除
抗體說明書樣本
Product Name NFkB p105 / p50 antibody [E381] (注:E381 是指克隆號(hào))
Product type Primary antibodies
Description Rabbit monoclonal [E381] to NFkB p105 / p50
Immunogen A synthetic peptide corresponding to residues in the
nuclear factor NFkB p50 subunit.
Reacts with Hu, Ms, Rat (注:人小鼠 大鼠)
Specificity This antibody will detect both forms: p50 and p105.
Tested
applications
Flow Cyt, ICC, IHC-P, WB(流式細(xì)胞分析免疫細(xì)胞化學(xué) 免疫組織化
學(xué)-石蠟包埋 western bloting)
Application notes Recommended dilutions
Flow Cyt: 1/30.
ICC: 1/250 - 1/500.
IHC-P: 1/250 - 1/500.
WB: 1/5000. Detects bands of approximately 50 and 105 kDa
(predicted molecular weight: 50 and 105 kDa).
Is unsuitable for IP.
Not yet tested in other applications.
Optimal dilutions/concentrations should be determined by the end
user.
Positive control HeLa cell lysate; human prostate carcinoma
Cellular localization Nuclear, but also found in the cytoplasm in an inactive form
complexed to an inhibitor (I kappa B).
Research areas Cancer >> Signal transduction >> Nuclear signaling >> NFkB pathway
Chromatin >> Transcription >> Transcription Factors
Nuclear Signaling >> Nuclear Signaling Pathways >> NFkB pathway
Nuclear Signaling >> Transcription >> Other factors
Cell Biology >> Signal Transduction >> Nuclear Signaling >> NFkB
Pathway
Immunology >> Innate Immunity >> Macrophage / Inflamm.
Cell Biology >> Apoptosis >> Intracellular >> NFkB >> p50
Relevance NFkB is a transcription regulator that is activated by various intra and
extra cellular stimuli such as cytokines, oxidant free radicals,
ultraviolet irradiation, and bacterial or viral products. NFkB is a family
of transcription factors that consists of homo and heterodimers of
NFkB1/p50 and RelA/p65 subunits, and controls a variety of cellular
events including development and immune responses. All members
share a conserved amino terminus domain that includes dimerization,
nuclear localization, and DNA binding regions, and a carboxy terminal
transactivation domain. Serines 529 and 536 in the transactivation
domain of RelA/p65 are phosphorylated in response to several stimuli
including phorbol ester, IL1 alpha and TNF alpha as mediated by IkB
kinase and p38 MAPK. Serine 529 is located in a negatively charged
region (amino acids 422-540) that is phosphorylated in response to
phorbol myristate acetate plus calcium ionophore activation.
Phosphorylation of serines 529 and 536 is critical for RelA/p65
transcriptional activity. Activated NFkB translocates into the nucleus
and stimulates the expression of genes involved in a wide variety of
biological functions. Inappropriate activation of NFkB has been
associated with a number of inflammatory diseases while persistent
inhibition of NFkB leads to inappropriate immune cell development or
delayed cell growth.
Alternative names for NFkB p105 / p50 antibody [E381] (ab32360)
Database links The links below go to external sites and will open in a new browser
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Entrez
Gene
4790 (Human)
18033 (Mouse)
81736 (Rat)
GeneCar
d
GC04P103880 (Hum
an)
Omim 164011 (Human)
SwissPr
ot
P19838 (Hum
an)
P25799 (Mous
e)
Q63369 (Rat)
Unigene 431926 (Huma
n)
Raised in Rabbit
Clonality Monoclonal
Clone number E381
Isotype IgG
Purity Protein A purified
Storage buffer Preservative: 0.01% Sodium Azide
Constituents: 40% Glycerol, 0.05% BSA, 0.15M Sodium chloride,
50mM Tris glycine. pH 7.4
Material safety datasheets (MSDS) for this product:
Form Liquid
Storage instructions Shipped at 4°C. Upon delivery aliquot and store at -20°C. Avoid freeze
/ thaw cycles.
NFkB p105 / p50 antibody [E381] images:
Western blot - NFkB p105 / p50 antibody [E381] (ab32360)
NFkB p105 / p50 antibody [E381] (ab32360) at 1/5000 dilution + HeLa cell lysate
Predicted band size : 50 kDa
Observed band size : 50,105 kDa
Immunohistochemistry (Paraffin-embedded sections) - NFkB p105 / p50 antibody
[E381] (ab32360) |
