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ELISA即酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，是一種常用的固相酶免疫測定方法。Engvall 和Perlmann于1971年最先應(yīng)用該法進(jìn)行了IgG定量測定，并命名為“enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)”。 由于ELISA方法靈敏，特異性強(qiáng)不需要特殊設(shè)備，所以被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測定［1］。如乙肝、丙肝抗體等等。但ELISA測定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術(shù)要求，在臨床檢驗(yàn)中除正常反應(yīng)外，有時(shí)?？梢姷揭恍╁e誤結(jié)果（即假陽性或假陰性結(jié)果）。本文就ELISA檢測的影響因素做如下討論。 1 標(biāo)本的影響 1.1 溶血標(biāo)本及混有紅細(xì)胞的血清采用ELISA法檢測易產(chǎn)生假陽性 可能是溶血血清中含有過氧化酶物質(zhì)（紅細(xì)胞或血紅蛋白中的亞鐵血紅素），在洗滌過程中往往難以完全洗脫，它可使H2O2釋放出原生態(tài)氧(O)，從而催化底物四甲基聯(lián)苯胺生成可溶性的有色物質(zhì)，即顯藍(lán)色，產(chǎn)生假陽性［2］。所以嚴(yán)重溶血標(biāo)本禁用。 1.2 標(biāo)本受細(xì)菌污染 因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，因此，被細(xì)菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測定結(jié)果。 1.3 標(biāo)本保存不當(dāng) 在冰箱中保存過久的標(biāo)本，在間接法ELISA測定中會導(dǎo)致本底過深、造成假陽性；為克服上述干擾，ELISA測定的血清標(biāo)本宜為新鮮采集；如不能立即測定，5 d內(nèi)測定的血清標(biāo)本可存放于4℃，1周后測定的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存；凍存后融解的標(biāo)本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混合后再測定，但混勻時(shí)應(yīng)輕柔，不可強(qiáng)烈振蕩。 1.4 塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性 最好使用真空采血管；并使用非抗凝標(biāo)本，肝素抗凝血漿會增加OD值，EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性。 1.5 標(biāo)本凝固不全 2 試劑影響 ELISA檢測試劑廠家較多；不同廠家出產(chǎn)的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別，使用質(zhì)劣的試劑必然導(dǎo)致結(jié)果的假陽性或假陰性。因此，選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵之一。 3 操作技術(shù)的影響 3.1 吸量的準(zhǔn)確性 吸量不準(zhǔn)確，直接影響檢測結(jié)果。因此加樣器也要經(jīng)常清洗，定期校準(zhǔn)。 3.2 溫浴影響 抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對溫度有嚴(yán)格要求，酶標(biāo)板周圍與內(nèi)部孔升降溫速率不同，造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果差異；干浴與水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，減少受熱不均，貼密封膜，防止污物浸入。 3.3 加樣次序影響 有時(shí)我們在加樣過程中，常常會遇到個別標(biāo)本未離心等情況，為了節(jié)約時(shí)間，往往這時(shí)我們會先加酶結(jié)合物，然后等標(biāo)本分離好后再加標(biāo)本，這樣，竟常常會造成HBeAb和HBcAb的假陰性。因?yàn)镠BeAb和HBcAb都是競爭抑制法，先加入酶標(biāo)記的抗體，首先與固相載體上的抗原結(jié)合，待加入顯色劑后，因酶的存在而顯色，故呈陰性［3］。 3.4 洗滌方法對結(jié)果的影響 洗滌是ELISA操作的重要環(huán)節(jié)，手洗條件一致性較差，對結(jié)果影響較大，全自動洗板機(jī)使用不當(dāng)也會影響結(jié)果，血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機(jī)針小孔處于阻塞狀態(tài)，造成未結(jié)合標(biāo)記酶洗脫不徹底，導(dǎo)致“花板”造成假陽性或假陰性；所以操作洗板機(jī)過程中要不時(shí)觀察洗板機(jī)針孔內(nèi)洗液的通暢狀況，洗板機(jī)不用時(shí)應(yīng)用去離子水清洗幾遍。 4 干擾物質(zhì)的影響 有人認(rèn)為大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結(jié)果；常見的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其他物質(zhì)等。如RF因子可與標(biāo)記二抗的FC段法結(jié)合造成假陽性，高濃度的AFP（如孕婦），在儲存過程中可能形成二聚體會導(dǎo)致本底過深影響檢測結(jié)果。 綜上所述，對臨床檢驗(yàn)ELISA測定中出現(xiàn)的假陽性或假陰性結(jié)果，要從多方面進(jìn)行分析除試劑因素和操作因素之外，更多的應(yīng)從標(biāo)本因素方面進(jìn)行分析，并采取相應(yīng)措施排除干擾作用，從而為臨床提供正確可靠的檢測結(jié)果。 【參考文獻(xiàn)】 |
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