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作者：陸亭屹 徐萍    作者單位：黔南州疾病預(yù)防控制中心,貴州 黔南 558000

　HIV抗體檢測是發(fā)現(xiàn)HIV感染的有效途徑，而對疑似艾滋病HIV感染者的實(shí)驗(yàn)確診是防治艾滋病的重要環(huán)節(jié)。隨著我國HIV感染人數(shù)的逐年增加，人們對艾滋病病毒的檢測日益重視。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測HIV抗體是衛(wèi)生部推薦的首選方法，此法特異性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡單易行，既適宜于大樣本的篩查試驗(yàn)，也可用于單個樣本的測定，但檢測結(jié)果的正確性易受多種因素的影響。為進(jìn)一步提高HIV初篩實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，最大限度減少HIV抗體檢測可能出現(xiàn)的誤差，本文對實(shí)驗(yàn)室中溶血血清、不同的血清量、溫育時間、終止比色時間等影響的因素加以探討。

　　1  材料與方法

　　1.1 儀器   

　　BIO-R55O型酶標(biāo)儀(美國產(chǎn))；Fluido型洗板機(jī)(鄭州產(chǎn))；干式孵育箱(上海市醫(yī)療器械廠生產(chǎn))；E06010122型移液器(日本產(chǎn))。

　　1.2 試劑  

　　A試劑:北京萬泰公司生產(chǎn)的ELISA抗2HIV(1＋2)抗體試劑盒(批2批檢合格，批號20070909)。B試劑:新創(chuàng)公司生產(chǎn)的ELISA抗2HIV(1＋2)抗體試劑盒(批2批檢合格，批號2007076605)。由貴州省疾控中心艾滋病防治所供給。

　　1.3 樣品  

　　取自都勻市少管所監(jiān)測點(diǎn)的HIV抗體初篩陽性血清。

　　1.4 方法  

　　取10份HIV初篩的陽性血清，每份血又分為兩份，一份是正常分離的非溶血血清，另一份是通過人為機(jī)械溶血分離的血清。用兩個不同生產(chǎn)廠家的ELISA抗2HIV(1+2）試劑盒，操作嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行，在有效期內(nèi)使用。在相同的溫度下，對同一樣品進(jìn)行不同血清(非溶血與溶血)、不同血清量(萬泰100 μl全量、50 μl，新創(chuàng)50 μl全量、25 μl)、不同溫育時間(37℃溫育30 min與20 min及加終止液后立即比色，5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min等不同時間比色進(jìn)行比較。判斷臨界值的設(shè)定北京萬泰為Cut off值=0.12+N(陰性對照平均值), 英科新創(chuàng)為Cut off值=0.10+N(陰性對照平均值)，樣本OD值小于Cut off值為陰性，大于或等于Cut off值為陽性。

　　2   結(jié)果

　　2.1 兩種試劑同時測定非溶血與溶血樣本HIV抗體,兩樣本的OD值差異均無顯著性(P>0.05)，與有關(guān)報導(dǎo)不同[1,2](見表1)。
表1   非溶血與溶血血清OD值比較略（

　　2.2 不同溫育時間的比較  

　　兩種試劑的結(jié)果各不相同，A試劑非溶血與溶血樣本37℃溫育30 min和20 min之間OD值差異無顯著性(P>0.05)。B試劑37℃溫育30 min和20 min之間OD值差異有顯著性(P<0.01,見表2)。表2   不同溫育時間OD值比較 （略）

　　2.3 HIV抗體陽性血清樣本不同血清量結(jié)果OD值差異均有顯著性(P<0.05,見表3)。表3  不同血清量OD值比較（略）

　　2.4 加終止液后用雙波長(450 nm,630 nm)在不同時間掃描(比色)對結(jié)果的影響

　　加終止液后隨著時間的增加，OD值逐漸下降，而且濃度越高其OD值隨時間下降越快。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)弱陽性的HIV質(zhì)控血清，其OD隨時間增加而變化較小。陽性血清OD值比色時間延遲 5 min后，各時間段與第一次相比 ,結(jié)果有明顯變化(見表4)。從表中看出比色時間對ELISA的檢測結(jié)果影響明顯。表4   不同時間比色OD值兩兩比較（略）
　　3  討論
 
　　在ELISA試驗(yàn)中溶血標(biāo)本對HBsAg和麻疹抗體測定的影響均有報道[3,4]， 對HIV抗體測定的影響報道少見，本次實(shí)驗(yàn)用A、B兩種試劑對非溶血和溶血標(biāo)本測定HIV抗體的OD值比較，兩種血清OD值結(jié)果間差異均無顯著性(P>0.05)，雖然溶血標(biāo)本對ELISA測定HIV抗體結(jié)果影響較小，但在測定HIV抗體時，抽血和分離血清應(yīng)盡量避免溶血，但對抽血困難和運(yùn)輸過程中造成個別溶血標(biāo)本應(yīng)多次反復(fù)測定，警惕假陽性出現(xiàn)，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。
 
　　溫育時間是影響ELISA法測定HIV抗體結(jié)果可靠性的關(guān)鍵因素之一。溫育時間不夠，會導(dǎo)致弱陽性樣本漏檢，溫育時間過長，液體蒸發(fā)，使非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗徹底。在相同溫度下，不同溫育時間的OD值比較，萬泰試劑與新創(chuàng)試劑的結(jié)果有所不同，說明不同生產(chǎn)廠家的試劑對溫育時間敏感性不同。因此，在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)按說明書步驟嚴(yán)格控制溫育時間，以保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
 
　　本次結(jié)果表明陽性血清量的多少對結(jié)果的準(zhǔn)確性影響很大。筆者認(rèn)為：操作過程中樣本及試劑應(yīng)垂直加樣，不可太快，若加樣過快，容易濺出和產(chǎn)生氣泡，難以保證加樣量的準(zhǔn)確性。 非垂直加樣易加在微孔非包被區(qū)，致非特異性吸附. 加樣過猛易使樣本(試劑)濺出對鄰近孔產(chǎn)生污染，產(chǎn)生氣泡使液面差異致酶標(biāo)儀測定出現(xiàn)誤差，為確保加入試劑的準(zhǔn)確性，應(yīng)使用精密移液器,不可使用滴瓶滴加。
 
　　從表4可見，加終止劑后，在不同時段讀取各孔OD值與第一次進(jìn)行比較，結(jié)果差異有顯著性 (P<0.01)。各時間段與前一次比較，A試劑10 min以后各時段與前一次比較差異均無顯著性(P>0.05)，而B試劑25 min以前各時段與上一次比較差異均有顯著性(P<0.01)。說明不同生產(chǎn)廠家的試劑在加終止液后隨著時間的增加，OD值下降的速度不同。目前各生產(chǎn)廠家的HIV抗體篩查試劑，加終止劑后沒有規(guī)定具體的比色時間，建議各試劑生產(chǎn)廠家應(yīng)對其最佳的時間加以說明。本次結(jié)果顯示，加終止劑后5 min比色結(jié)果比較理想，實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量有限，有待大樣本證實(shí)。
 
　　掌握HIV初篩實(shí)驗(yàn)室基本操作技能和技術(shù)，每一步操作應(yīng)認(rèn)真仔細(xì)，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行對操作環(huán)節(jié)各方面的影響應(yīng)全面的了解，并能進(jìn)行有效控制，提高HIV初篩實(shí)驗(yàn)室的HIV抗體檢測準(zhǔn)確率，為艾滋病的控防工作提供科學(xué)依據(jù)。

【參考文獻(xiàn)】
  　　[1] 殷勤. 溶血對抗-HIV測定結(jié)果的影響[J].實(shí)用醫(yī)技雜志,2004，11(10):2142-2143.

　　[2] 劉國剛, 鐘海明, 胡金元.ELISA法檢測HIV抗體的幾點(diǎn)體會[J].中華醫(yī)學(xué)實(shí)踐雜志,2004,3(10):907.

　　[3] 鐘筑寧, 谷俊瑩, 肖文革. 對影響ELISA實(shí)驗(yàn)質(zhì)量的有關(guān)因素分析[J].貴州醫(yī)藥,2005,29(12):1131-1132.

　　[4] 黎劍華, 鄭澤紅.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)一步法檢測麻疹I(lǐng)gM抗體影響因素探討[J].中華現(xiàn)代兒科學(xué)雜志,2005,2(7):642-643.

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