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一．熒光PCR原理
1．熒光共振能量傳遞 (FRET) 某熒光標記基團在激發(fā)光刺激下生成某波長的發(fā)射光，當另一屏蔽基團與其距離合適時，原發(fā)射光將會被屏蔽基團所吸收，并轉(zhuǎn)化為其他波長的發(fā)射光或熱能，稱之為FRET。 2．熒光化學： 熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。 二．實時熒光PCR技術(shù)靶基因的確定及引物和探針的設計原則 1．靶基因的確定：選擇檢測組共有的基因以避免檢測的假陰性(漏檢)。 2．檢測片段的確定：選擇檢測組內(nèi)的保守 (突變少)（避免假陰性）、組間特異的序列 (突變多)（避免假陽性）作為引物探針的設計位置。片段長度70-150bp。 3．引物：長度17-25bp;GC含量30-80%;退火溫度(Tm值)58-60℃；避免穩(wěn)定的引物二聚體（特別是多聯(lián)檢測）及發(fā)夾結(jié)構(gòu)(自由能大于-3.5kc/m)；序列不能出現(xiàn)連續(xù)的G，3’端避免G或C，最后5個堿基內(nèi)避免兩個以上的G或C。 4．探針：長度20-30bp（Taqman)或16-25bp(MGB)；GC含量30-80%；Tm值為68-70℃；避免穩(wěn)定的二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu) (自由能大于-3.5kc/m)；5’端不能是G；位置盡量靠近上游引物；選擇波長差異較大（多聯(lián)檢測）或Fam(單聯(lián)檢測）的熒光標記。 三.特點和優(yōu)勢 1．特異性強：引物和探針的“雙保險”，避免檢測的假陽性。 2．靈敏度高：分析PCR產(chǎn)物的對數(shù)期，自動化儀器收集熒光信號，避免了許多人為因素干擾。 3．避免污染：全封閉反應，無須PCR后處理。 4．實現(xiàn)定量：運用標準品獲得標準曲線，結(jié)合Ct值進行準確定量。 5．高效低耗：可實現(xiàn)一管多檢。 6．操作簡便：在線式實時監(jiān)測擴增結(jié)果，不必接觸有害物質(zhì)。 7．快速：反應時間<1.5小時。 四．實用意義： 1．提高檢測效率，縮短檢測周期，提高通關速度； 2．降低檢測成本，提高經(jīng)濟與社會效益。 |
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