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ELISA是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的簡(jiǎn)稱(chēng)，是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫酶技術(shù)。它以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合，由于抗原、抗體反應(yīng)在一種固相載體— 一、試劑的選擇 優(yōu)良的檢測(cè)試劑對(duì)于結(jié)果準(zhǔn)確的必要性不容置疑。注意操作嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，試驗(yàn)前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘。 二、加樣 (一)可能出現(xiàn)的問(wèn)題 1．血清或血漿標(biāo)本分離不好即進(jìn)行加樣或者待檢標(biāo)本污染或溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。 2．手工操作中，加樣板過(guò)多造成加樣后放人孵箱前等待時(shí)間長(zhǎng)(特別是室內(nèi)溫度較高時(shí))，或者加樣不準(zhǔn)確，各孔標(biāo)本或試劑含量有差別。 3．加完標(biāo)本再加酶試劑時(shí)酶濺出。 (二)解決方法 1．可用作ELISA測(cè)定的標(biāo)本十分廣泛，體液(如血清)、分泌物(如唾液)和排泄物(如尿液、糞便)等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測(cè)定(如血清、尿液)，有些則需經(jīng)預(yù)處理(如糞便和某些分泌物)。大部分ELISA檢測(cè)均以血清為標(biāo)本。標(biāo)本為血清：最好將血液先于室溫放置1-2小時(shí)后，再用3000r／min離心lO分鐘；標(biāo)本若為血漿，必須使用含抗凝劑的血液標(biāo)本收集管，采血后立即顛倒采血管混合5-10次，放置一段時(shí)間后，3000r／min離心15分鐘。血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)，如在冰箱中保存過(guò)久，其中的蛋白質(zhì)可發(fā)生聚合，在間接ELISA中可使本底加深。一般說(shuō)來(lái)，在5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4~C，超過(guò)一周測(cè)定的需低溫冰存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻，宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和。 2．在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加樣后及時(shí)放入孵箱溫育。 3．從冰箱中取出的試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。加酶試劑后用吸水紙?jiān)诿笜?biāo)板表面輕拭吸干。 4．標(biāo)本較多時(shí)，請(qǐng)分批操作。 三、孵育 在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育。此過(guò)程中可能出現(xiàn)的問(wèn)題有：孵育時(shí)未貼封片或加蓋，使標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā)．吸附于孔壁，難于清洗徹底。故應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間，應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確，如果孵育時(shí)間人為延長(zhǎng)，將導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周?chē)y以徹底清洗。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板。 四、洗板 洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELISA就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。采用手工洗板時(shí)，孔與孔之間液體交叉。采用半自動(dòng)洗板機(jī)洗板時(shí)，洗液量不足可能導(dǎo)致洗板不徹底；洗板針堵塞，可能導(dǎo)致抽吸不完全；洗板不暢可能導(dǎo)致洗板效果差；反應(yīng)板過(guò)多可能導(dǎo)致洗板等待時(shí)間長(zhǎng)。以上情況均可造成結(jié)果誤差，解決的方法是保證洗液注滿各孔，洗板釘暢通，洗完板后最好在吸水紙(選擇干凈、無(wú)塵的吸水材料)上輕輕拍干；合理安排洗板時(shí)間，交替操作。 五、顯色 顯色是ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。顯色劑盡量在臨用前配制，不用過(guò)期顯色劑肉眼可見(jiàn)淺藍(lán)色的TMB顯色劑堅(jiān)決不用；當(dāng)室溫較低時(shí)應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)顯色時(shí)間；加樣時(shí)保持顯色劑不外流以免造成液體回流；A、B液應(yīng)避免接觸金屬器械。 六、終止 加終止液時(shí)產(chǎn)生較多氣泡，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性增加，在操作中加以注意就能避免。 七、讀板 讀板時(shí)板底如不清潔也可能造成讀數(shù)不準(zhǔn)。酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽(yáng)光或強(qiáng)光照射下，操作時(shí)室溫宜在15-30℃，使用前先預(yù)熱儀器l5～3O分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。
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