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改造免疫效應(yīng)細(xì)胞以治療癌癥在過去的幾年里取得了巨大的進(jìn)步，嵌合抗原受體（CARs）被廣泛用作重定向自體T細(xì)胞，可特異性針對淋巴白血病和淋巴瘤，且具有顯著的臨床結(jié)果。已被報(bào)道的重大突破即急性淋巴細(xì)胞性白血?。ˋLL），據(jù)報(bào)道在單次靶向CD19的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行化療之后，盡管有些病例中其細(xì)胞存活時(shí)間不長，總緩解率可達(dá)90%。（即使是在重度預(yù)處理的兒童和成年人中）早期試驗(yàn)CD19-CAR-T細(xì)胞的良好成果使得目前有很多人努力爭取讓這門治療技術(shù)得到更廣泛的使用。

盡管如此，CAR-T細(xì)胞還是具有一些實(shí)際應(yīng)用上的限制。為個(gè)人產(chǎn)生的自體移植的CAR-T細(xì)胞很難處理，也很難運(yùn)用到廣泛的臨床層面。制作CAR-T細(xì)胞一般需要好幾周，這就使得它無法治療一些會(huì)迅速發(fā)展的疾病。但是，要從重度預(yù)處理的病人體內(nèi)收集足夠允許成功臨床運(yùn)用的淋巴細(xì)胞（通常是淋巴細(xì)胞）也并非會(huì)總是成功。同種異體的“現(xiàn)成的”產(chǎn)物可以克服這個(gè)不足，雖然，通過原生α-Β T細(xì)胞受體（TCR）的異體T細(xì)胞（即使和人體白細(xì)胞抗原[HLA]匹配）具有移植抗宿主病（GVHD）的重大風(fēng)險(xiǎn)。

NK細(xì)胞是高細(xì)胞毒性免疫因子，通過非特定的方式殺死他們的靶細(xì)胞。NK細(xì)胞沒有造成GVHD的潛質(zhì)，也提供了制作“現(xiàn)成的“同種異體的可用于免疫臨床治療的可能性，此外，正如報(bào)道所說，因?yàn)楦脑旌蟮腘K細(xì)胞仍會(huì)保留原本具有的抗體，當(dāng)CAR-T細(xì)胞的特異性靶向抗原數(shù)量減少的時(shí)候，NK細(xì)胞仍具備通過其機(jī)制抗癌的能力，這在理論上可以降低癌癥復(fù)發(fā)的概率，CAR靶向抗原減少時(shí)的產(chǎn)生的耐藥性也可以得到減緩。因此，NK細(xì)胞的這種內(nèi)在特性使得NK細(xì)胞成為可幫助免疫治療的候選之一。通過基因改造引入抗原靶點(diǎn)來增加NK細(xì)胞的抗腫瘤翻譯是一個(gè)在癌癥免疫腫瘤學(xué)領(lǐng)域可深入研究的課題。

在本篇綜述中，我們針對NK細(xì)胞工程的最新進(jìn)展，特別是關(guān)于NK細(xì)胞在基因改造后可能和T細(xì)胞一樣可以有效識(shí)別并殺死目標(biāo)的臨床前證據(jù)進(jìn)行描述。我們旨在討論引入CARs為主要的NK細(xì)胞和其他NK細(xì)胞系提供靶向抗體，定向改良NK細(xì)胞的挑戰(zhàn)性、臨床前以及早期臨床研究中支持以CARs改良過的NK細(xì)胞的效率的證據(jù)。

NK細(xì)胞是一種運(yùn)用毒性快速對抗癌癥以及病毒感染細(xì)胞的無需抗原預(yù)先致敏的先天免疫因子，于是便有了“自然殺手“這一稱號(hào)。NK細(xì)胞調(diào)節(jié)的細(xì)胞毒性發(fā)生在無限白細(xì)胞抗原的情況下（HLA），這也是癌癥免疫療法中的理想情況，盡管NK細(xì)胞在遇到并識(shí)別人類白細(xì)胞抗原（HLA）蛋白后具有細(xì)胞毒性，這也被稱為獲得“許可”或NK細(xì)胞的學(xué)習(xí)過程。NK細(xì)胞的特點(diǎn)是不表達(dá)CD3/TCR復(fù)合物、缺少CD16和CD56膜抗原的表達(dá)。大多數(shù)NK細(xì)胞存在于外周血、肝臟、脾臟和骨髓中，在淋巴結(jié)中相對存在較少。

NK細(xì)胞的功能包括細(xì)胞脫粒、細(xì)胞因子的釋放、細(xì)胞毒性，由可識(shí)別細(xì)胞上配體的抑制受體、異二聚體C型凝集素受體[NKG2A]和激活受體（特別是自然殺傷受體[NCRs]NKp ] NKp46, NKp30, NKp44,以及C型凝集素激活受體 NKG2D7）接收到的信號(hào)之間的平衡來調(diào)控。這些受體也因此需要機(jī)制防止自己被無意識(shí)的激活進(jìn)而對抗正常組織，即“自我耐受性”。 HLA類蛋白和KIRs（iKIRs）相結(jié)合傳遞抑制信號(hào)，進(jìn)而使NK細(xì)胞的效應(yīng)反應(yīng)的過程被阻斷。通過一個(gè)所謂的“丟失自我”的假設(shè)概念，當(dāng)成熟的NK細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槿狈LA的細(xì)胞，這個(gè)過程會(huì)發(fā)生在病毒或惡性轉(zhuǎn)化過程中，其表面的抑制性受體沒有被激活。在這個(gè)情況下，NK細(xì)胞也沒有收到抑制性信號(hào)。同時(shí)，在病毒或惡性轉(zhuǎn)化過程中會(huì)發(fā)生細(xì)胞應(yīng)激和DNA受損，細(xì)胞應(yīng)激激活NK細(xì)胞受體，使NK細(xì)胞殺死靶細(xì)胞。NK細(xì)胞可以通過分泌含穿孔素和顆粒酶，表達(dá)TNF家族因子來殺死腫瘤細(xì)胞，比如FasL和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL），兩者通過各自受體的相互作用誘導(dǎo)腫瘤凋亡。此外，依賴抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）是通過與Fc受體CD16來調(diào)節(jié)的，這可以觸發(fā)NK細(xì)胞脫粒以對抗膜抗體靶細(xì)胞。缺少CD56的NK細(xì)胞高表達(dá)CD16，而高表達(dá)CD56的NK細(xì)胞低表達(dá)或不表達(dá)CD16（Fig.1）

NK細(xì)胞的快速殺傷能力和廣泛的細(xì)胞毒性使NK細(xì)胞具有致敏作用，使其可以被用作過繼治療。在體外，NK細(xì)胞通過細(xì)胞毒性可對抗多種血液惡性腫瘤，其中有AML、ALL、MM（急性髓細(xì)胞白血病，急性淋巴細(xì)胞性白血病，多發(fā)性骨髓瘤）以及一些固體腫瘤，其中有神經(jīng)母細(xì)胞瘤，卵巢癌、結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌（腎癌）和胃癌。然而，許多腫瘤都有其避免被NK細(xì)胞殺傷的策略。舉個(gè)例子，一些白血病和淋巴瘤細(xì)胞表達(dá)維持HLA蛋白的高表達(dá)，從而避免他們被NK細(xì)胞攻擊，或者缺少激活NK細(xì)胞受體的信號(hào)配體。因此，許多團(tuán)隊(duì)探索可提高NK細(xì)胞活性的策略，包括使用細(xì)胞因子和人工抗原呈遞細(xì)胞（APCs）蛋白共刺激作為以促進(jìn)增殖。在細(xì)胞因子進(jìn)一步的孵化中，特別是IL-2,IL-5，NK細(xì)胞獲得了溶解新鮮的和培養(yǎng)的腫瘤靶點(diǎn)的能力，這些靶點(diǎn)通常對于NK細(xì)胞的溶解作用是不敏感的。

另一個(gè)策略是于單克隆抗體聯(lián)合治療以提高ADCC。NK細(xì)胞有許多來源，這也可從多個(gè)團(tuán)隊(duì)的證明中得知。盡管擴(kuò)增、活化的自體NK細(xì)胞的過繼治療在臨床試驗(yàn)中安全、具有耐受性，但其療效依然有限。這可能和HLA的自體抑制有關(guān)。來自同種異體源的NK細(xì)胞為免疫治療提供了一個(gè)有希望的選擇?；钴S的NK細(xì)胞具有的最有前景的特征是他們具有在不導(dǎo)致GVHG的情況下促進(jìn)移植對抗白血病、腫瘤Gvl、GvT），以及采用預(yù)處理和移植后設(shè)定的過繼運(yùn)輸同等位基因的NK細(xì)胞的臨床研究。過繼轉(zhuǎn)移同種異體NK細(xì)胞在血癌和固體腫瘤中是安全的，盡管他們的臨床活動(dòng)比較溫和。許多團(tuán)隊(duì)，包括作者，正在探索通過基因改造進(jìn)一步提高NK細(xì)胞殺死腫瘤能力的策略。

CARs可用于改造可通過體白細(xì)胞抗原在腫瘤表面識(shí)別抗原并殺死其目標(biāo)的免疫效應(yīng)細(xì)胞。CARs是胞外抗原結(jié)合區(qū)域，通常是來源于單克隆抗體和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域的單鏈可變片段（scFv），一般是TCR的CD3ζ鏈。CARs在臨床上被用于直接、特異的改造T細(xì)胞，關(guān)于CAR-T細(xì)胞的研究也。不管怎樣，靶向CD19的CAR-T細(xì)胞有著迅速的反應(yīng)和持續(xù)的對于淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤的緩解作用，特別是急性淋巴細(xì)胞性白血?。ˋLL），這也激發(fā)了在臨床對進(jìn)一步研究和優(yōu)化CAR-NK細(xì)胞的熱情。

相比CAR-T細(xì)胞，使用CAR-NK細(xì)胞有著其他的優(yōu)點(diǎn)。比如說，過繼治療時(shí)采用自體和同種異體的NK細(xì)胞在體內(nèi)的持久性是有限的。缺乏克隆增殖的NK細(xì)胞以及免疫介導(dǎo)的對NK細(xì)胞的排斥作用使得在幾天內(nèi)或者幾周內(nèi)不大可能出現(xiàn)釋放綜合征(CRS)。。而且，盡管一部分病在接受了CAR-T細(xì)胞之后沒有出現(xiàn)GVHD（移植抗宿主?。?/span>，大部分CAR-T細(xì)胞研究還是使用了同種異體的T細(xì)胞。因?yàn)橥N異體的T細(xì)胞（即使是可和人體白細(xì)胞抗原結(jié)合的）通過原生α-Β T細(xì)胞受會(huì)造成移植抗宿主病。而NK細(xì)胞不會(huì)引起GVHD（移植抗宿主?。?，這一點(diǎn)已經(jīng)通過患有血癌及固體惡性腫瘤患者的單倍體和臍帶血（CB）NK細(xì)胞的融合得到了證明。因此，NK細(xì)胞提供了生產(chǎn)現(xiàn)成同種異體的可立即用于臨床使用的產(chǎn)品的機(jī)會(huì)。此外，比起CAR-T細(xì)胞，CAR-NK細(xì)胞可以通過他們識(shí)別和靶向腫瘤細(xì)胞的天然受體保留其潛力，相比T細(xì)胞，NK細(xì)胞靶向CAR的抗原下調(diào)更少。有一種潛在的提高NK細(xì)胞能力的方式，即捐贈(zèng)和KIR受體不匹配的CAR-NK細(xì)胞，或是基于單倍體B KIR基因含量的細(xì)胞，兩者都有利于同種異體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

以前不愿意使用NK進(jìn)行CAR改良治療的原因很大程度上是因?yàn)椴淮_定它的遷移和滲透腫瘤組織的能力，以及對于CAR-T細(xì)胞還不夠有信心。這樣的想法也和NK細(xì)胞在體內(nèi)的持續(xù)性時(shí)間有限相關(guān)，持續(xù)時(shí)間短雖然保證了NK細(xì)胞的安全性，但也限制了它的功效。此外，現(xiàn)在有關(guān)基因改良NK細(xì)胞的技術(shù)還不夠成熟，T細(xì)胞利用腺病毒傳導(dǎo)的成功也對比出了不同水平下NK細(xì)胞傳染的低可行性。但是，最近有關(guān)病毒性傳導(dǎo)和電穿孔的技術(shù)，又重燃了對NK細(xì)胞基因修飾的熱情。也許現(xiàn)在最大的挑戰(zhàn)并不是發(fā)展合適的CAR療法，暫且不論效應(yīng)細(xì)胞的來源，最大的挑戰(zhàn)應(yīng)該是很難找到合適的免疫靶抗原。理想的免疫靶抗原應(yīng)該是能被所用腫瘤細(xì)胞表達(dá)的而正常組織不表達(dá)或極少表達(dá)的，這樣才會(huì)使其僅僅針對于腫瘤細(xì)胞發(fā)生作用。

NK細(xì)胞主要來自于外周血、臍帶血（CB）、或造血干細(xì)胞祖細(xì)胞（HSCPs），NK細(xì)胞系被成功的修飾并表達(dá)CARs以對抗靶細(xì)胞，其中很多使用了CAR-T細(xì)胞，CAR-NK細(xì)胞在體內(nèi)或體外殺死腫瘤靶細(xì)胞時(shí)都是高效率的，盡管迄今還沒有關(guān)于使用CAR-NK細(xì)胞治療的臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)報(bào)道。

NK細(xì)胞過繼治療的研究可以從幾個(gè)不同的來源來研究.80而自體NK細(xì)胞可以在體外可重復(fù)產(chǎn)生，它們在對抗自體腫瘤時(shí)活性有限，可能不是很容易通過改造細(xì)胞表達(dá)CAR來克服這一缺陷的. 同種異體NK細(xì)胞可以從健康的捐贈(zèng)者的PB中產(chǎn)生或從CB中擴(kuò)大出來。

無論來源如何，擴(kuò)大的、活化的CB或PB衍生的NK細(xì)胞都有許多特征，使它們成為基因修飾的有用的效應(yīng)物。擴(kuò)大，活化的NK細(xì)胞通常表達(dá)一系列活化受體，包括CD16，NKG2D和NCR（NKp44 NKp46），盡管捐助者的捐助者的變化。這些活化的NK細(xì)胞配備著KIR和 “殺人執(zhí)照” 。它們在體內(nèi)擴(kuò)增和持久力，雖然不如轉(zhuǎn)移T細(xì)胞，卻與血液系統(tǒng)惡性腫瘤的抗腫瘤活性等試驗(yàn)存在明顯聯(lián)系，如AML。此外，體外擴(kuò)增原代人NK細(xì)胞能比T細(xì)胞產(chǎn)生不同光譜的細(xì)胞因子，包括：干擾素（IFN）-γ，IL-3其中G、細(xì)胞和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF），這可能與CRS的低風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。如上所述，與CAR修飾的NK細(xì)胞，絕大多數(shù)仍停留在經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合CAR改裝初級(jí)人類NK細(xì)胞將對一些血液和實(shí)體腫瘤抗原，如CD19、CD20、GD2，和HER-2重新靶向治療。

許多CAR-NK細(xì)胞最初的臨床前的研究主要集中針對帶有抗CD19和CD20-CARs惡性B細(xì)胞腫瘤。雖然淋巴細(xì)胞缺失后再輸注cd19-car-t細(xì)胞導(dǎo)致患者CD19+腫瘤復(fù)發(fā)或惡性劇烈反應(yīng)，但是伴有BL復(fù)發(fā)的患者反應(yīng)則不強(qiáng)烈。 因此，制定針對BL中的CD20的第二代靶向CD20 NK-CAR蛋白，并利用mRNA轉(zhuǎn)染產(chǎn)生。這抗-CD20-4-1BB-CD3ΖCAR被用于基因修飾來自健康獻(xiàn)血者中的PB NK細(xì)胞，，其在基于K-562飼養(yǎng)細(xì)胞系的存在下被激活，并表達(dá)IL-15和4-1BB配體（K562-MBIL15-41BBL）。在CAR mRNA轉(zhuǎn)染僅僅16小時(shí)后，50%–95%的擴(kuò)增的PB NK細(xì)胞表達(dá)CAR蛋白，并且相比于只用利妥昔單表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的體外對抗利妥昔單敏感和耐藥的BL細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。，同時(shí)延長Raji移植小鼠生存。非病毒轉(zhuǎn)染、電穿孔技術(shù)介導(dǎo)的表達(dá)可以產(chǎn)生強(qiáng)大的CAR介導(dǎo)的殺死，這些CAR蛋白的短暫活性特性會(huì)很可能決定在臨床上需要重復(fù)注射治療。

我們組最近開發(fā)出一種新的方法來產(chǎn)生CAR-CD19+ NK細(xì)胞的，我們認(rèn)為解決了所有上述限制。我們用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（IC9 /CAR。19、IL15）來修飾CB來源的NK細(xì)胞，這樣（1）與CAR CD19基因重組重新特異性的靶向CD19；（2）異位產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-15這對NK細(xì)胞的存活和擴(kuò)增至關(guān)重要。（3）表達(dá)自殺基因，誘導(dǎo)caspase-9（ic9）藥理活性，必要時(shí)可消除轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。這些基因修飾使工程N(yùn)K細(xì)胞維持足夠數(shù)量，并在異種移植小鼠模型中保持強(qiáng)大的有效殺滅B細(xì)胞白血病或淋巴瘤細(xì)胞的功能。

盡管如此從初級(jí)NK細(xì)胞報(bào)告中必須考慮到捐贈(zèng)者，修飾細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法（病毒或非病毒轉(zhuǎn)染）以及不同的擴(kuò)增方式對于內(nèi)在固有的NK細(xì)胞功能的很大的差異性。而多數(shù)臨床前報(bào)告由于它們廣泛的轉(zhuǎn)染效率，效率范圍從1%-90%，在原代NK細(xì)胞利用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白相對于逆轉(zhuǎn)錄病毒具有獨(dú)特的優(yōu)勢。它不需要活性的分離的細(xì)胞株，這使得轉(zhuǎn)染原代以及非激活的細(xì)胞成為可能。（盡管在非擴(kuò)張NK原發(fā)性細(xì)胞被使用的很少）。盡管逆轉(zhuǎn)錄或病毒載體是被用來通過講外源基因整合到宿主細(xì)胞基因組上確保轉(zhuǎn)基因持久性表達(dá)，一些非病毒的轉(zhuǎn)染方法也給一一研究出來。這些方法包括電穿孔，使得CAR編碼的mRNA通過細(xì)胞膜上的微孔轉(zhuǎn)染進(jìn)去。使得CAR蛋白瞬時(shí)表達(dá)。然而考慮到電轉(zhuǎn)與單純的慢病毒轉(zhuǎn)染使得PB或CB誘導(dǎo)的NK細(xì)胞顯著的低轉(zhuǎn)染率（在同一報(bào)道中分別＜10%和＜30%），逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白可能更適用于用來對原發(fā)性或CB NK細(xì)胞進(jìn)行修飾。針對這一問題可能解決的辦法是在引發(fā)誘導(dǎo)干細(xì)胞（iPSCs）以及隨后的成熟NK細(xì)胞分化過程中，接下來討論了其他來源的NK細(xì)胞的情況。表一總結(jié)了迄今為止利用原代CAR NK細(xì)胞的臨床前試驗(yàn)研究。

盡管支持使用擴(kuò)增的，活化的CAR-NK細(xì)胞取得了令人鼓舞的數(shù)據(jù)，大多數(shù)發(fā)表的研究報(bào)告利用NK細(xì)胞系表達(dá)CAR蛋白。雖然存在幾個(gè)NK細(xì)胞系（NKG，YT，NK-YS、HANK-1、YTS細(xì)胞、NKL細(xì)胞），研究最廣泛的是NK-92，一個(gè)人類NK樣細(xì)胞系最初是從一個(gè)非霍奇金淋巴瘤（NHL）病人那里建立的。NK-92細(xì)胞缺乏幾乎所有KIRs抑制子除了KIR2DL4。在NK-92中缺乏的KIRs細(xì)胞可能至少部分地解釋了它們在體外針對廣譜腫瘤靶點(diǎn)的顯著活性。⁸有希望的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果使得NK-92細(xì)胞早期被用于超過40種人類惡性腫瘤。然而，盡管重復(fù)注射的NK-92細(xì)胞比較安全，效果仍然有限；因此，許多團(tuán)隊(duì)正在探索利用CAR改裝以提高這些細(xì)胞的抗腫瘤活性的使用。

基因改造有許多理論上的優(yōu)勢。NK-92細(xì)胞系優(yōu)于原代NK細(xì)胞。其是一個(gè)已建立好的具有依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)冷凍保存細(xì)胞庫的操作方法能成功復(fù)制和擴(kuò)增的同質(zhì)細(xì)胞系的特征。是一個(gè)能持續(xù)擴(kuò)增的細(xì)胞系并且具有“無限”的數(shù)量，使NK細(xì)胞在CAR治療中擁有足夠的代數(shù)與有用的數(shù)量。近年來，一些團(tuán)體，修飾了NK-92細(xì)胞表達(dá)不同的CARs來針對血液和實(shí)體惡性腫瘤，包括CD19和CD20的B細(xì)胞白血病/淋巴瘤，CD38和CS-1多發(fā)性骨髓瘤、和HER-2上皮腫瘤、 CAR修飾的NK-92細(xì)胞也可以通過瘤內(nèi)注射，使它們能夠傳播到腫瘤部位。并發(fā)揮他們的作用是通過類似疫苗的機(jī)制。此外，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率在原發(fā)性NK細(xì)胞中有很大差異，當(dāng)轉(zhuǎn)導(dǎo)NK-92時(shí)，CAR的表達(dá)與其轉(zhuǎn)染效率有更一致相關(guān)性，這大部分歸因于其細(xì)胞系的同質(zhì)性。轉(zhuǎn)導(dǎo)NK-92細(xì)胞效率平均約50%，即使使用非病毒方法如電穿孔轉(zhuǎn)染或核酸轉(zhuǎn)染。

雖然一些研究已經(jīng)證實(shí)了作為大規(guī)模擴(kuò)增和使用NK-92細(xì)胞作為異基因細(xì)胞免疫療法的安全性與可行性。 NK-92細(xì)胞有固有的缺點(diǎn)必須加以考慮。臨床上最顯著的缺點(diǎn)包括他們潛在的致瘤性（因?yàn)镹K-92細(xì)胞來自NHL患者），多種細(xì)胞遺傳學(xué)異常和潛伏感染Epstein Barr病毒（EBV）。因此，為安全起見，NK-92細(xì)胞在進(jìn)入臨床使用之前要經(jīng)過X照射。之前多數(shù)團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，1000個(gè)劑量的輻射足夠使得植入的NK—92細(xì)胞對體外細(xì)胞毒性的影響最小。輸液前的輻射處理很可能會(huì)對它們在體內(nèi)的增殖，持續(xù)能力和長期的抗腫瘤作用產(chǎn)生負(fù)面影響。 CAR-T細(xì)胞的效用是由其持久性決定的，同樣，體內(nèi)NK細(xì)胞過繼輸注療效已依賴于它們在體內(nèi)的擴(kuò)增與持久能力。此外，我們已經(jīng)在淋巴瘤小鼠模型中證明了在表達(dá)CAR的 NK細(xì)胞體內(nèi)的持久性對有效的持久的抗腫瘤免疫的重要性，重復(fù)注射輻射后的NK-92細(xì)胞是可行的，可作為一種手段規(guī)避他們有限的持久性，但是這樣一種方法很可能會(huì)誘發(fā)異基因細(xì)胞系抗體和細(xì)胞免疫以及每次輸注后更快的排斥反應(yīng)。此外，NK細(xì)胞缺乏幾種典型的活化表達(dá)受體（例如，NKP44和NKP46110120），他們不表達(dá)內(nèi)源性Fc受體，因此不能調(diào)控ADCC。為了克服后者的缺點(diǎn)，一NK-92細(xì)胞衍生表達(dá)fcrRⅢ高親和力的變種已經(jīng)被發(fā)展起來，這種高親和變異也被證明在原代NK細(xì)胞是有用的，因?yàn)橹挥?0%的人口自然攜帶這種多態(tài)性。表2總結(jié)了CAR修飾的NK細(xì)胞株的臨床前研究結(jié)果。

另一種適合CAR表達(dá)的NK細(xì)胞來源是人類多能干細(xì)胞（hPSCs）。人類胚胎干細(xì)胞（胚胎干細(xì)胞）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）可以無限期地保存并提供幾乎無限NK細(xì)胞的供應(yīng)。最近有一份實(shí)驗(yàn)方法針對從冷凍CB分離出人CD34 + HPSCs 再對NK細(xì)胞進(jìn)行分化，然后將其修飾表達(dá)CD19-CAR蛋白。該團(tuán)隊(duì)還描述了無飼養(yǎng)層方法：利用胰島素樣生長因子1從hPSCs中收集基因修飾過的NK細(xì)胞。，這種方法有可能被用來作為一個(gè)平臺(tái)來表達(dá)其他的CAR蛋白。

所有的car-nk構(gòu)建到目前為止討論是細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈cd3ζ，它針對表面表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原的細(xì)胞.賦予特定的細(xì)胞毒作用。另一個(gè)吸引人的戰(zhàn)略是發(fā)展car-nk細(xì)胞靶向活化的NK受體如NKG2D受體，NKG2D配體包括主要組織相容性復(fù)合體（MHC）I類鏈相關(guān)發(fā)展目標(biāo)配體（MICA），MICB，和幾個(gè)UL-16-結(jié)合蛋白（ULBPs），它們在多種腫瘤細(xì)胞和病毒感染的細(xì)胞表面高表達(dá)。因此， NKG2D CAR具有潛在識(shí)別大約90%的人類腫瘤類型的功能^.126這種方法的其他好處是， CAR不僅識(shí)別腫瘤細(xì)胞也識(shí)別NKG2D配體表達(dá)的免疫抑制細(xì)胞，如髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）。然而，NKG2D配體也在各種生理?xiàng)l件下誘發(fā)的，如炎癥。這引起了人們對“靶標(biāo)/非腫瘤”毒性的關(guān)注。雖然NK細(xì)胞通常表達(dá)NKG2D，但表達(dá)NKG2D的CAR相比于內(nèi)源性NKG2D受體能大大提高他們的活性。NKG2D缺乏胞漿區(qū)的信號(hào)模體及其連接信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過DNAX激活磷酸化蛋白10（DAP10），從而招募下游信號(hào)效應(yīng)蛋白和誘發(fā)細(xì)胞毒性^.為了測試超生理激活信號(hào)是否可以提高NK介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、常等。用DAP10 與NKG2D / CD3ζCAR在來源于不同的惡性腫瘤多個(gè)細(xì)胞系中共表達(dá)用來檢測NK細(xì)胞活性，ALL，骨肉瘤，前列腺癌和橫紋肌肉瘤中表現(xiàn)出最好的反應(yīng)。全部這種策略的一個(gè)缺點(diǎn)是在一些原發(fā)性惡性血液病中激活配體存在下調(diào)或丟失，這可能會(huì)影響NKG2D介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)，NKG2D配體的表達(dá)和NKG2D-DAP10—cd3ζ受體介導(dǎo)的細(xì)胞整體水平毒性作用兩者之間沒有顯著的相關(guān)性。

為了建立一種CAR能通過另一條路線去激活NK細(xì)胞、托普弗等130在中納入DNAX激活蛋白12（DAP12）作為一種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，以及前列腺干細(xì)胞抗原（PSCA）單鏈抗體（來源于雜交瘤7F5）這兩個(gè)因素。DAP12在NK細(xì)胞中表達(dá)與一系列的受體激活相關(guān)，包括C型凝集素受體NKG2C，自然細(xì)胞毒性受體NKp44，和激活KIRs KIR3DS1與KIR2DS1/2/5，在體外和在小鼠模型中，抗PSCA-DAP12 CAR能夠在原發(fā)性NK細(xì)胞和NK細(xì)胞系YTS中表達(dá)并能溶解其他抗PSCA+ B/C和HLA-C配型的腫瘤細(xì)胞。有趣的是，YTS NK CAR與DAP-12信號(hào)域組合與單獨(dú)的抗-PSCACD3Ζ-CAR NK細(xì)胞相比其特異性殺傷力有所提高。據(jù)我們所知，這項(xiàng)工作是展示一個(gè)免疫受體酪氨酸活化模體（ITAM）- 包含DAP12 CAR與作為一個(gè)以cd3ζ為基礎(chǔ)的CAR一樣對啟動(dòng)激活下游的信號(hào)有效，其中包含三個(gè)ITAMs。重要的是，在體外激活和發(fā)揮細(xì)胞毒性上，這DAP12信號(hào)的CAR不需要額外的共刺激信號(hào)蛋白，作者推測這對于的DAP12介導(dǎo)NK細(xì)胞的活化是沒有必要。

除了CAR修飾，另一種有前途的治療策略包括改造NK細(xì)胞表達(dá)已知對促進(jìn)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性是非常重要的細(xì)胞因子。這種方法還可以提高NK細(xì)胞的持久性和不需要在補(bǔ)充體內(nèi)細(xì)胞因子的有毒操作。然而，一個(gè)顯而易見的問題是誘發(fā)CRS和其他的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的全身毒性。還有一個(gè)遠(yuǎn)大于理論的風(fēng)險(xiǎn)在誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化中的轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞存在持續(xù)的自分泌刺激，這種現(xiàn)象在 IL-2-改造的 T細(xì)胞被觀察到。我們團(tuán)隊(duì)試圖通過短暫的IL-2和IL-15編碼轉(zhuǎn)染來避免細(xì)胞毒性利用一種短暫的（穩(wěn)定）的表達(dá)模式如NK細(xì)胞mRNA電穿孔轉(zhuǎn)染。

盡管CAR-NK細(xì)胞有前途的臨床結(jié)果，并且其未改性NK細(xì)胞也已建立安全說明以及最近在臨床上成功使用CAR-T細(xì)胞，但截至2016年12月，只有兩CAR-NK的細(xì)胞治療的臨床試驗(yàn)有積極療效的患者（NCT00995137 ST.JUDE兒童研究醫(yī)院NCT01974479從國家大學(xué)健康系統(tǒng)，新加坡）。這兩個(gè)試驗(yàn)是針對難治性CD19+ALL患者并攜帶同樣的第二代抗CD19CAR與4-1BB共刺激域（anti-cd19-bb-ζ），將其轉(zhuǎn)染入單倍型相合供體NK 細(xì)胞。而圣裘德試驗(yàn)只對兒科病人開放，不接受注冊。新加坡的試驗(yàn)正在積極招收兒童和成人。在這劑量遞增試驗(yàn)，兒科和成人患者接受單一靜脈注射（IV），按照0.5×107到1× 108 CD56+細(xì)胞/公斤輸注抗-CD19-BB-ζ NK細(xì)胞。這些臨床結(jié)果等待進(jìn)一步研究。

在過去的幾個(gè)月里，一些涉及car-nk其他試驗(yàn)細(xì)胞治療已在ClinicalTrials.gov登記過。Persongen的生物療法，立足于中國，獲得監(jiān)管部門的批準(zhǔn)進(jìn)行幾次試驗(yàn)以控制第三代的連續(xù)劑量（相關(guān)scFv附著TCRζ，CD28和4-1BB信號(hào)結(jié)構(gòu)域）CAR轉(zhuǎn)染NK-92細(xì)胞（0, 3，5天）。這個(gè)團(tuán)隊(duì)的目標(biāo)是難治性CD7+白血病/淋巴瘤成人患者（NCT02742727），CD33 +髓系惡性腫瘤的兒童和成人患者（NCT02944162），難治性兒童和成人CD19+惡性腫瘤并計(jì)劃接受造血干細(xì)胞移植患者（HSCT）（NCT02892695）。該小組還針對MUC1+復(fù)發(fā)和難治性實(shí)體腫瘤（NCT02839954）。我們組還計(jì)劃進(jìn)行臨床研究，以檢驗(yàn)CB誘導(dǎo)的NK細(xì)胞逐步增大的劑量的安全性和有效性。在2017年初其被改造并在復(fù)發(fā)或難治性B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤患者表達(dá)IC9.CAR19.CD28-ζ-2A-IL-15。

在CAR-NK治療可以擴(kuò)展到更大的患者隊(duì)列中之前還有一些科學(xué)問題和監(jiān)管障礙有待解決。雖然關(guān)于NK細(xì)胞有強(qiáng)而有力的方法描述了其的分離、擴(kuò)增和轉(zhuǎn)導(dǎo)，制備細(xì)胞仍然是很繁重。與慢病毒結(jié)構(gòu)相比，逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)具有更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，但也攜帶較高突變插入的潛在風(fēng)險(xiǎn)，這種風(fēng)險(xiǎn)，這在很大程度上仍然是理論上的（除了在X連鎖嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷患者中的人群中）[SCID]，Wiskott Aldrich，或慢性肉芽腫性疾病中），因此來在人類使用此治療之前將有不同的監(jiān)管調(diào)控阻礙。電穿孔法，除了在技術(shù)上更簡單和更嚴(yán)格監(jiān)管，還能避免使用病毒載體和致癌基因的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)以及激活和插入突變.然而，有些團(tuán)隊(duì)報(bào)告的用臨床級(jí)別的電穿孔儀在體外NK-92的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)80%–90%的大多數(shù)發(fā)表的報(bào)告中顯示原代NK細(xì)胞體外擴(kuò)增的的研究是令人失望的，轉(zhuǎn)染效率低至10%，而且，CAR蛋白的表達(dá)只有短暫的活性，通常是持續(xù)<7天，137天，這可能會(huì)對CAR-NK細(xì)胞長期療效產(chǎn)生負(fù)面影響。而很少有報(bào)告公開探討轉(zhuǎn)導(dǎo)對NK細(xì)胞生存力、表型和功能的影響，現(xiàn)有的數(shù)據(jù)表明轉(zhuǎn)導(dǎo)對這些因素的影響微乎其微。

還需要探討的另一個(gè)概念是淋巴細(xì)胞缺失治療是否是預(yù)防同種異體CAR NK細(xì)胞的排斥反應(yīng)所必須的。除了誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞減少，淋巴細(xì)胞化療法在腫瘤微環(huán)境中清除其他免疫細(xì)胞如Treg和MDSCs，這可能會(huì)對NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性或其在體內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)生負(fù)面影響。最后，鑒于最近關(guān)于注射CAR修飾的T細(xì)胞的安全問題，是否要將自殺的系統(tǒng)（例如，基于caspase-9和胸苷激酶）納入到基因修飾結(jié)構(gòu)中考慮。

另外一個(gè)未解答的問題包括是否重復(fù)注射能引發(fā)的免疫原性，特別是由于大多數(shù)的scFvs是鼠抗，并可能引起人抗鼠抗體（HAMAs）或細(xì)胞介導(dǎo)的排斥/致敏作用。隨著CAR-T細(xì)胞注射后，HAMA免疫原性的研究得到了廣泛的研究。在CAR-T細(xì)胞的研究中，它不是一個(gè)重要的問題，可能是因?yàn)榇蠖鄶?shù)患者都單次輸注自體細(xì)胞。較少的報(bào)告討論了細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，在這種情況下，使用同種異體NK細(xì)胞可能使這個(gè)問題變得不那么理論化反而更實(shí)用。

進(jìn)一步研究探索最佳的載體、構(gòu)建和轉(zhuǎn)導(dǎo)方法對于免疫治中識(shí)別“完美的NK CAR”是必要的。

未來幾年將為基因改造NK細(xì)胞提供臨床驗(yàn)證，并有可能形成免疫療法的未來。更多組合技術(shù)將被測試以提高NK細(xì)胞治療的腫瘤特異性，無論是通過利用NK細(xì)胞固有的能力，抑制或敲除免疫監(jiān)管點(diǎn)，或針對腫瘤微環(huán)境。目前正在研究的過繼性T細(xì)胞治療引入額外基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（TALEN），也將被用于在NK細(xì)胞的改造中，有一些團(tuán)隊(duì)顯示了這些技術(shù)的臨床前可行性（納瓦羅，2016，自然免疫學(xué)會(huì)，會(huì)議）。這樣的策略伴隨著對他們自己的重大監(jiān)管，并且到目前為止，只有一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中使用這項(xiàng)技術(shù)，并在積極招募患者，雖然針對NY-ESO1和PD-1試驗(yàn)在不斷發(fā)展。

盡管仍有許多問題， CAR-NK細(xì)胞有望成為一種新的治療難治性惡性腫瘤的細(xì)胞免疫療法。值得注意的是，NK細(xì)胞可以產(chǎn)生一個(gè)現(xiàn)成的產(chǎn)品，可作為治療患者的同一性質(zhì)產(chǎn)品，消除那些個(gè)性化和特定病人治療物的需要，這是當(dāng)前CAR-T細(xì)胞治療缺陷。NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性能更通過表達(dá)CAR更有效地直接對難治性腫瘤，這可能有助于癌癥治療的新范式的轉(zhuǎn)變。

參考文獻(xiàn)：

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